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Duftstoffanalysen an Orchideen im Regenwald Costa Ricas

Duftstoffanalysen an Orchideen im Regenwald Costa Ricas
Ylahdeur
Mag. pharm. Dr. Robert MĂŒntz publizierte in der "Homöopathie in Österreich" Herbst 2023 Ausgabe der ÖGHM - Österreichische Gesellschaft fĂŒr Homöopathische Medizin

Vor 40 Jahren fĂŒhrte mich Abenteuerlust an den Amazonas, wo mich das Virus befiel, in den folgenden Jahrzehnten immer wieder verschiedene RegenwĂ€lder zu besuchen. Viele Jahre spĂ€ter wurde ich sesshaft und fand einen Platz im Zentralmassiv Costa Ricas, fĂŒr dessen Schutz und Erhalt ich mich seither einsetze.

Ich grĂŒndete das „Reserva Biologica Guaitil SA“ zum Schutz der Ökologie auf privater Basis: Es besteht aus 80 % PrimĂ€rwald in einer Höhenlage von 800 bis 1800 Metern und grenzt in einem Talschluss an den Nationalpark Tapanti. Das verbleibende Areal als ehemaliges Weideland habe ich im Laufe der letzten 10 Jahre durch 1800 JungbĂ€ume wieder aufgeforstet und bald bemerkte man diesen Schritt an der Fauna-Entwicklung. Kapuzineraffen und BrĂŒllaffen, die frĂŒher bejagt wurden, zogen wieder in das Areal zurĂŒck und Wildkameras zeugen von einer vitalen Population an Großkatzen wie Ozelot und Puma.

Ich durfte aber auch feststellen, dass das 200 ha große Gebiet einen großen Orchideenbestand aufweist. Mit jedem Besuch entdeckte ich neue Arten und dies brachte mich zum Entschluss, zwei meiner Leidenschaften miteinander zu verbinden: Das Bewandern von Waldgebieten mit dem Sammeln von herabgefallenen Epiphyten, um sie in der NĂ€he der Basisstation aufzubinden und der Analytik Arbeit im Labor der Reference Analytics GmbH in Eisenstadt. Ich immatrikulierte an der grĂ¶ĂŸten Pharmazeutischen FakultĂ€t in Deutschland - an der Philipps UniversitĂ€t Marburg/Lahn und stellte mir als SpĂ€tberufener die Aufgabe, eine wissenschaftliche Arbeit zum Thema der DĂŒfte von Orchideen dieses Gebietes zu schreiben. 

Beeindruckende DiversitÀt

Die Vielfalt in der Familie der Orchideen ist morphologisch bemerkenswert, die fast ubiquitĂ€r verbreitete Familie fĂ€llt mit einer unglaublichen VariabilitĂ€t im BlĂŒtenbau auf, wobei der Aufbau der OrchideenblĂŒte eng verwandt mit jenem der LiliengewĂ€chse ist. Gleichzeitig ist sie auch eine phylogenetisch junge Familie, die eine auffallend hohe DiversitĂ€t hinsichtlich Evolution bzw. Koevolution mit ihren BestĂ€ubern durchlaufen hat. Aktuell zĂ€hlt man 30.000 bis 35.000 verschiedene Arten, davon sind 1800 in Costa Rica anzutreffen. 

Analytik

Meine Herangehensweise zu Beginn der Dissertation bestand zunĂ€chst darin, ein DuftsammelgerĂ€t zu entwickeln, mit dem es möglich war, einerseits in Freilandversuchen DĂŒfte zu sammeln, ohne dabei die intensive Waldluft mit aufzunehmen. Andererseits fand ich eine FĂŒlle von Miniaturorchideen vor, deren Duft mit der Nase nicht wahrnehmbar ist. Bei denen stellte auch das rein apparative Sammeln der DĂŒfte eine Herausforderung dar. Die bisher praktizierte Methode der Sammlung mittels Erlenmeyerkolben, Solid Phase Micro Extraction (SPME) und der GC/MS Analyse erwies sich im Freiland als nicht einsetzbar.

Ich setzte mit gutem Erfolg die Ă€ußerst empfindlichen und zugleich einfach anzuwendenden Carbonadsorbentien „MonoTrap¼“ RGC18TD (Artikel NR 105-74201) der Firma GL-Science ein. Diese wurden nach der Beprobung in einem Headspace-FlĂ€schchen nach Österreich versendet und in unserem Labor der Reference Analytics GmbH analysiert (Doppelreiter, 2023). 

Pflanzliche Duftstoffe

Die Duftstoffe (Volatile Organic Compound, VOC) zĂ€hlen zu den sekundĂ€ren Metaboliten von Pflanzen, welche in vier chemische Gruppen eingeteilt werden, es sind die Phenole, Alkaloide, Flavonoide und Terpenoide. Sie ĂŒben zahlreiche, fĂŒr den Erhalt der Spezies wichtige Funktionen aus. Die Gruppe der Terpen-Duftstoffe ist dabei mit 800.000 Stoffen die weitaus grĂ¶ĂŸte.

Sie alle sind Teil des Kommunikationsweges, den die Pflanze mit der Umgebung aufrecht hĂ€lt. Die VOC sind flĂŒchtige Botenstoffe, die von der Pflanze ausgeströmt werden, allen voran die Volatile Terpenoids (VT). Sie prĂ€gen den Geruch der Pflanzen und sind so die wichtigste Möglichkeit, mit der Umwelt in Wechselwirkung zu treten.

Terpenoide sind die grĂ¶ĂŸte Gruppe sekundĂ€rer Metaboliten des Pflanzenreichs, sie haben vielfĂ€ltige Strukturen und werden vom GrundgerĂŒst der MevalonsĂ€ure und in der Folge des Isoprens bzw. 2-Methyl-1,4,-butadien (C5-Baustein) abgeleitet.

Etwa 75% aller Orchideen haben einen Duft bzw. verbreiten bei Normaltemperatur flĂŒchtige Stoffe, die fĂŒr den Menschen geruchlos erscheinen, jedoch die Pollinatoren anzulocken vermögen. Diese Stoffe werden in geringsten Mengen in den DuftstoffdrĂŒsen (Osmophore) gebildet und gespeichert und werden zu bestimmten Zeiten freigegeben.

Als Speicherform liegen Terpenoide in den Osmophoren glycosidisch gebunden vor und können im Bedarfsfall (Stress, mechanische Verletzung, Anlockung von BestÀubern und Verbreitung der Samen) durch hydrolytische Spaltung aktiviert und freigesetzt werden (Boncan, et al., 2020).

Die Substanzen selbst wĂ€ren fĂŒr die Pflanze toxisch, sie sind in Speicherzellen in Blatt, BlĂŒte und Wurzel zu finden. Die Lippe ist als Landeplatz fĂŒr die BestĂ€uberinsekten meist der am intensivsten duftende Bereich der Orchideen, den stĂ€rksten Geruch verbreiten Vertreter von Catasetum und Gongora.

Die IntensitÀt des Verströmens von Duft ist von verschiedensten Faktoren abhÀngig:

  • Wird beispielsweise die Catasetum-BlĂŒte mit Pollen bestĂ€ubt, setzt die Geruchsentwicklung fĂŒr einige Stunden aus, um offenbar die gesamte Energie der erfolgreichen Befruchtung zu widmen.
  • Orchideen mit braunen BlĂŒten besitzen hĂ€ufig einen an Aas erinnernden Geruch, da sie Aasfliegen als natĂŒrlichen BestĂ€uber haben. Diese an verrottetes Fleisch erinnernde BlĂŒtenfarbe gepaart mit dem Geruch an Aas zieht ihre Pollinator-Insekten an, und diese transportieren in der Folge die PollensĂ€cke.
  • Üblicherweise duften Orchideen nur zu bestimmten Tageszeiten, was mit der AktivitĂ€t ihrer spezifischen Befruchter einhergeht. Es kann sich auch im circadianen Lauf der Geruch verĂ€ndern, wie beispielsweise bei Clowesia rosea: Ihr Geruch erinnert am Morgen an eine Brustsalbe, wohingegen sie am spĂ€teren Tag nach Zimt duftet(De L.C, 2014).
  • Ein Forscherteam untersuchte in Ecuador die AttraktivitĂ€t von kĂŒnstlichen BlĂŒten der Spezies Dracula lafleurii, die mit Hilfe eines 3D-Druckers hergestellt und bemalt wurden. Dabei imitierte die Lippe einen Pilz, der ausschließlich von bestimmten Fliegen besucht wurde. Das Interesse der BestĂ€uberinsekten war dreimal so groß, wenn die BlĂŒte auch den zuvor aufgebrachten Duft von Dracula lafleurii Man stellte auch fest, dass mittels Farbstiftes gepunktete Sepalen offenbar die Anwesenheit von weiteren Fliegen vortĂ€uschte, was die AttraktivitĂ€t eines Besuchs noch erhöhte (Policha, 2019).

 

Aufgabenstellung

Zentrale Aufgabe war die Ermittlung der Duftstoffzusammensetzung von Orchideen Guaitils, insbesondere von Miniaturorchideen, die bisher keine Bewertung gefunden hat. Weiters stellte ich mir der Frage, ob es bei den VOC-Verteilungsmustern dieses Gebietes Parallelen oder sich wiederholende Muster gibt, die von chemotaxonomischer Bedeutung sind.

Die Frage nach deren BestĂ€ubern wurde hier bewusst ausgeklammert, dies hĂ€tte die DurchfĂŒhrbarkeit dieser Feldstudie ĂŒberstiegen.

Der Duft ist neben der BlĂŒtenform und Farbe selektives Lockmittel fĂŒr BestĂ€uber, er hat also eine fĂŒr den Fortbestand einer Spezies wesentliche Bedeutung.

Als Kernaufgabe sah ich die PrĂŒfung mittels valider Methoden, ob es Kongruenzen im phylogenetischen Baum gibt, mit anderen Worten: Ob sich innerhalb des Orchideen Duftgeschehens Verwandtschaften abzeichnen und der Duft eine Möglichkeit der taxonomischen Zuordnung darstellt.

Die FĂŒlle von Messdaten wurde vor Auswertung einer ValiditĂ€tsprĂŒfung unterzogen, ĂŒber 3000 Messwerte in chemische Klassen geordnet, Chromatogramme, Spektren, GPS-Werte, chemische Formeln und Zeitpunkte der Messungen zugeordnet sowie Bildmaterial verknĂŒpft. Die Analysen der VOC-Gemische von Orchideen und der Waldluft wurden mit JMPÂź 16.1.0 der Firma SAS durchgefĂŒhrt und in zahlreichen Grafiken visualisiert.

Der erste Schritt war die grobe Sichtung der Ergebnisse auf eventuelle Ähnlichkeiten der VOC-Muster innerhalb der 55 vorgefundenen Gattungen.

  • Im zweiten Schritt wurden durch GegenĂŒberstellung der Counts innerhalb gleicher Gattungen auf chemische Ordnungen analysiert.
  • Schließlich wurde im dritten Schritt durch zahlreiche Mehrfachtestungen innerhalb 133 verschiedener Arten auf Parallelen geprĂŒft.

Von großer Bedeutung fĂŒr die finale Aussage waren jene Messungen, die an einer Art mehrmals zu unterschiedlichen Jahreszeiten durchgefĂŒhrt wurden. Untermauert wurde das Ergebnis dieser vier Jahre dauernden Arbeit durch die Analyse der VOCs einer Art, die zu unterschiedlichen Tageszeiten ermittelt wurden und schließlich wurde an einem Tag zur gleichen Uhrzeit der Duft einer Art an unterschiedlichen Standorten gemessen.

Beispiel an Ticoglossum krameri

Bei dieser Spezies mit vorerst subjektiv kaum wahrnehmbarem Duft wurde im 2 Stunden Intervall ĂŒber 24 Stunden Duft gesammelt, es konnten 19 Terpene im Spektrum nachgewiesen werden. Hier finden sich mit alpha-Copaen und beta-Funebren zwei fast ganztĂ€gig messbare Komponenten, alle ĂŒbrigen verteilen sich auf die Nachtzeit bis 8 h in den Morgen. TagsĂŒber gibt es kaum feststellbare Duftstoffe, die Duftkonzentration steigt wieder ab 22 h an. Hier trifft die Faustregel zu, dass weißblĂŒhende Arten nachts einen Duft verströmen.



Die eingangs gestellte Frage nach Kongruenzen zwischen Duftmustern und dem phylogenetischen Baum konnte ich negativ beantworten, da die Ergebnisse zwar valides Datenmaterial darstellen, dieses aber keine ĂŒbergeordnete RegelmĂ€ĂŸigkeit aufweist. Somit legt die vorliegende Duftstoffanalyse an 55 verschiedenen Orchideengattungen und 133 Arten den Schluss nahe, dass eine chemotaxonomische Einordnung von Orchideen anhand ihrer VOCs nicht möglich ist (MĂŒntz, 2023).

Im Verlauf dieser Untersuchung durfte ich eine bisher weltweit unbekannte Art aus der Gattung Stellilabium entdecken. Das Institut der UniversitĂ€t Costa Rica – Lankester Garden schlĂ€gt den Namen Stellilabium muntzii vor. 


Stellilabium muntzii benannt nach Robert MĂŒntz.

Literaturverweise

Boncan, D., Tsang, S., Li, C., Lee, I., Lam, H.-M., Chan, T.-F., & Hui, J. (2020). Terpenes and Terpenoids in Plants: Interactions with Environment and Insects. (S. Licensee MDP Basel, Hrsg.) International Journal of Molecular Sciences, 21/7382, S. 1-19.

De L.C, R. P. (2014). Medicinal and Aromatic Orchids. (L. Chandra, Hrsg.) by-nc-nd, S. 242-249.

Doppelreiter, A. (6. 6 2023). Reference Analytics - Massgeschneiderte Lösungen fĂŒr jede analytische Herausforderung. Abgerufen am 6. 6 2023 von https://reference-analytics.com/

MĂŒntz, R. (2023). Charakterisierung der OrchideendĂŒfte im Gebiet von Reservea Biologica Guaitil, S.A., Costa Rica. Marburg/Lahn: Phillips UniversitĂ€t Marburg.

Policha, T. (2019). Dracula orchid flowers mimic mushrooms to attract flies. New Scientist(10).